k1体育宫内免疫作为后备母猪和经产母猪安全有效的免疫途径使用传染病疫苗对保护猪群至关重要，尤其是在动物量多的产业化畜舍。传统来说，疫苗注射使用针头，动物需鼻捻保定，或使用针刺枪装置。为猪等大型动物接种疫苗并非易事，存在安全隐患，大部分猪兽医都报告过针头刺伤， 其中40%发生于疫苗接种时（a.L.Hafer等，1996年）。随着大栏饲养成为趋势，动物自由混群移动，这使得安全操作针头注射型疫苗和跟踪已接种动物的难度更大。

　　可用粘膜接种替代针头，包括经口（水或饲料）、眼或鼻（Atul Srivastava等，2015年；Volker等，2006年）。粘膜接种大多无需针头，可降低兽医和猪场工作人员发生疫苗相关事故的频率（A.L.Hafer等，1996年）。一个成功的粘膜疫苗，接种于一个部位后，在粘膜部位及血液中也将诱导免疫反应（Gerdts等，2006；A.Srivastava等，2015）。由于绝大多数病原通过粘膜进入体内，强大的粘膜免疫反应可在病原穿过上皮屏障前，就消除病原，对于子宫而言，可保护发育中的胚胎免受病原侵袭。然而设计成功的粘膜疫苗面临诸多挑战，比如能避免疫苗因粘膜表面的粘膜液而流失，能募集和靶向抗原呈递细胞（APC），需确定疫苗穿过上皮屏障的合适剂量和体积（Woodrow et al.，2012a，2012b），但不诱导免疫耐受（如微生物群、食物和环境颗粒中的抗原需要免疫耐受（Czerkinsky et al.，1999））。

　　虽然口服、眼用和鼻内疫苗适用于仔猪免疫，但对初产母猪和经产母猪等成年动物而言，依旧有难度，可能需要保定。我们正在研究经猪子宫接种，作为另外一种粘膜途径，比粘膜途径更具优势。处于发情期的初产母猪或经产母猪，接近公猪或其信息素雄烯酮时，它们会为爬跨做准备而表现出站立反应，躯体僵直（Dorries等，1997）。母猪的人工授精（AI）在商品化猪场司空见惯，每年数次，该途径是一种安全、简便的方法，将疫苗接种的新方案融入现有的畜牧生产实践（Knox，2016；McNamara等，2013），每个配种周期，都可对子宫进行操作。综上，宫内免疫作为一种备选途径值得探索，但需要仔细选择佐剂和递送方法，以开发安全、有效和经济的疫苗。

　　尽管雌性生殖道在性成熟的动物是一个动态系统，在整个发情周期中，根据激素状态而改变，我们的目的是在动物发情，子宫颈开放的情况下，研究子宫内免疫的效果。开放的子宫颈可能会引入中的病原和/或诱导疫苗免疫反应。发情期外生殖道的细胞性质或反应，虽有趣，但于我们欲建立与生产实践相结合的疫苗接种目标并无助益。

　　子宫对k1体育·(中国)官方网站、精浆、细菌或病毒都会产生积极的免疫反应（Bischof，Lee等，1994年），这种反应对于清除多余精子至关重要（Katila，2012年）。配种在猪引起炎症性免疫反应，导致细胞因子和趋化因子释放到生殖道内（Katila，2012；Rozeboom等，1999）。另一项研究表明，保存剂Androhep和精浆本身即可诱导IL-10、TGF-β、IL-8和TNF-α，然而，加入精子后，这些基因的表达水平降低，这表明精子可能有一定程度的抑制作用（Taylor等，2009）。

　　精浆和保存剂导致大量白细胞募集到子宫腔（包括APC），但大多数募集的细胞是多形核细胞（Rozeboom等人，1998年），它们不是宫内疫苗的目标细胞群（Hamonic等，2020年）。能促进子宫腔APC募集或直接刺激子宫内膜上皮细胞的佐剂，或许是使用添加了保存剂的，进行有效宫内免疫的关键。

　　图1 宫内疫苗的免疫机制：疫苗通过人工授精输送到子宫，以在母猪中产生抗体介导的细胞免疫反应。在初乳中产生抗体，并输送给哺乳的新生仔猪。

　　猪子宫的外层完全由柱状上皮覆盖，然而与和子宫颈不同，子宫有腺体上皮细胞，形成管状腺体，嵌入组织（Hussein等，1983）。上皮层下是一层血管丰富的结缔组织，与上皮层共同构成子宫内膜，子宫内膜厚度和上皮细胞高度随发情周期而变化（Edstrom，2009；Kaeoket，Persson，等.，2002；Lorenzen 等.，2015）。上皮细胞是所有粘膜表面和皮肤最外层的细胞，相邻细胞间存在紧密连接，形成屏障，防止病原侵入机体（Nusrat等，2000）。这些细胞通过几种模式识别受体（PRRs）的表达影响免疫系统。应对病原相关分子模式（PAMPs）的刺激，它们诱导细胞因子和趋化因子的分泌，在上皮屏障处启动病原免疫反应（Wira，Grant Tschudy.等，2005）。

　　子宫上皮细胞（UECs）作为子宫免疫反应的哨兵在包括人类在内的其他物种已被广泛研究，（Wira，Grant Tschudy等，2005年），UECs分泌细胞因子和趋化因子，随后募集免疫细胞应对免疫刺激（Schaefer等，2004年；Soboll等，2006年）。用polyI:C和CpG刺激猪UECs ，分别产生IL-6和IL-10，这与在小鼠和人类UECs细胞因子表达库试验中获得的结果一致。两者中，仅polyI:C诱导促炎细胞因子（Fahey等，2008；Hamonic等，2018；Soboll等，2006）。应对PRR信号，除分泌细胞因子和趋化因子外，猪粘膜表面上皮细胞分泌β防御素，直接消除微生物（Nijnik&Hancock，2009）。在人类和小鼠中，研究证明特殊的上皮细胞具有表达II类MHC并直接向T细胞呈递抗原的能力（Mulder等，2011；Wallace等，2001；Wira，Rossoll等，2005）。然而，至今未有猪上皮细胞表达II类MHC的研究（Mair等，2014），这强调了上皮细胞在免疫激活中的作用存在物种特异性差异。综上，鉴于猪子宫上皮细胞的PRR表达和分布规律与其他物种子宫上皮细胞一致，其具有探查侵入病原的哨兵功能。

　　子宫上皮屏障缺乏特殊的上皮细胞，如M细胞k1体育·(中国)官方网站，小肠内的这些细胞能够高效采集抗原并传递给下层的免疫细胞（Kim&Jang，2014；Woodrow等，2012a）。据报道，子宫内膜具有半成型的淋巴样聚合，遍布整个子宫内膜，通常位于腺上皮的基底外侧（Lorenzen等，2015）。子宫腔（Kaser等，2017年）及上皮下（Bischofk1体育·(中国)官方网站，Brandon等，1994年）含大量淋巴细胞。子宫内膜中的免疫细胞主要是淋巴细胞，虽在整个发情周期中，数量会有变化，但通常上皮下表面以CD8+T细胞居多，更深的结缔组织中以CD4+T细胞居多（Kaeoket，Dalin等，2002年）。浆细胞分散在整个子宫内膜，主要为分泌IgG的浆细胞（Hussein等，1983年）。最后，子宫抗原呈递细胞（APC）的分布，如巨噬细胞和DC（树突状细胞），发情期遍布于整个子宫内膜，但在发情周期的阶段，它们位于固有层深处，很少直接出现在上皮表面下方（Kaeoket，Dalin等，2002年；Kaeoket，Persson等，2002；Wira，Fahey等，2005年）。由于子宫没有粘膜相关淋巴组织（MALT），因此成熟树突状细胞的转运和抗原向T细胞的呈递发生在阔韧带处的引流淋巴结（Woodrow等，2012b）。同样，疫苗的配制和递送可直接导向正常的上皮细胞或募集到子宫腔或组织的免疫细胞。

　　所有疫苗的目标都是产生足够高的群体免疫水平，降低流通病原的水平，通过群体免疫保护易感风险最大的个体（Fine，1993）。亚单位疫苗被认为是更为安全的疫苗，因为它没有完整的病原递送（因此没有毒力返强的危险）。然而它们通常免疫原性较低，需要佐剂来提升（Bastola等，2017）。佐剂辅助跨上皮屏障摄取抗原，募集APC，激活APC，诱导免疫反应（Th1、Th2、Th17型T细胞或CTL），建立储存库并保护抗原不被降解（Awate等，2013年；Pashine等，2005年；Srivastava等，2015年）。成功的粘膜疫苗应答可能需要这些作用机制中的一种或多种。因此有效的疫苗配方可能需要包含多种佐剂（Garg等，2017）。然而，由于宫内疫苗与活精共同使用，佐剂和抗原组合不可对精子功能或活力产生负面影响。我们最初开始研究混合疫苗与时，将几种商品化猪疫苗以非常低的剂量与混合，发现它们都具有杀精作用。因此我们要搜寻不杀精的佐剂。我们使用可结合顶体活跃精子的花生凝集素进行计算机辅助精子分析和微观观察。通过剂量滴定测试商品化保存中的几种佐剂，我们发现宿主防御肽、poly IL:C(聚肌胞苷酸)和聚磷腈（TriAdj）、灭活的PPV和重组蛋白不会显著影响精子功能（Hamonic等，2020）。后续试验结果表明，配种时混用和PPV重组抗原或FliC抗原和/或灭活PPV加TriAdj进行宫内免疫不会影响精子功能或生殖力，胚胎发育健康，仔猪健康，断奶前日均增重与一般无异。这一结论还需要一些母猪数更大的试验来验证。虽然上述结果仅基于少数试验和数十只动物，但用TriAdj配制的宫内疫苗似乎不会对精子功能、胚胎活力、至少短期内的仔猪生长动力学产生负面影响（Choudhary等，2021；Hamonic等，2020）。

　　在猪等家畜使用宫内疫苗时，我们担心针对精子有可能产生的免疫反应，会导致今后的不孕不育或繁殖性能下降，人类、小鼠和兔使用精子特异性蛋白免疫后发生了这种情况（Clark&Schust，2013）。需仔细监测上百次宫内免疫和配种周期的影响，若导致繁殖性能降低，则不会被产业所接受。

　　已发现大鼠子宫单次接种疫苗可激发全身和局部的抗原特异性抗体介导的免疫反应（Wira&Sandoe，1989）。将绵羊红细胞两次直接接种于去卵巢大鼠的子宫腔中，在第二次免疫的2周后进行检测，发现子宫和分泌物中具有明显的IgA和IgG抗体反应。使用雌二醇可降低抗体水平（但不影响子宫抗体水平），表明这种反应依赖于激素。在两次免疫的动物唾液中也发现了IgG而非IgA抗体。不同于生殖道，雌二醇对唾液IgG水平没有影响。为在另一种动物模型中研究宫内免疫的效果，我们通过手术在兔的每个子宫角注入400微升，分别与TriAdj配制而成的卵清蛋白（OVA）、牛疱疹病毒的截短糖蛋白D（tGD）、猪细小病毒VP2和细菌硫氧还蛋白（rVP2-TrX）的融合蛋白（Pasternak等，2017）。对照组兔肌肉注射亚单位疫苗中的一种。两个途径接种的疫苗都在全身、局部（子宫）和远端粘膜（肺和）产生了抗原特异性体液反应。观察到的粘膜反应并不局限在上生殖道或在上生殖道内存在明显划分，反应程度似乎至少部分依赖于抗原。在后续研究中，以不同剂量分别将tgD或OVA疫苗（各以TriAdj配制）注入兔子宫腔，在32天后评估免疫反应（Pasternak等，2018）。宫内疫苗在血清中产生抗原特异性IgG和IgA，具有剂量依赖性。高、中剂量疫苗灌洗子宫和支气管肺泡可引起抗OVA和tgD的 IgG显著增加，但IgA抗体未显著增加。使用卵清蛋白（OVA）再次刺激高剂量疫苗组的脾细胞仅导致Th1细胞因子（IL2/IFNgamma）的基因表达略微显著增加，但无可观察到的增殖。我们必须指出，我们并未记录兔子的激素水平和/或任何表明它们处于发情期的迹象，因此很可能并非所有动物都处于发情周期的同一阶段。尽管如此，高剂量抗原在所有动物都能诱发免疫。总而言之，研究结果证实了子宫免疫系统经刺激具有产生基本反应的能力，该反应在宫内免疫后可触发全身和粘膜免疫。

　　我们首先研究了猪子宫免疫系统是否能对加强免疫产生反应（Hamonic等，2020年）。每次配种前，给猪肌肉注射含灭活猪细小病毒的商品疫苗。妊娠、分娩和断奶后，下一次配种采取宫内免疫。我们将佐剂TriAdj配制的灭活PPV，在经产母猪配种前，立即加入袋，对照母猪根据制造商指示的肌肉途径接种商品化细小病毒疫苗。对照组和宫内免疫组血清中的抗PPV IgG、IgG1和IgG2抗体相当。我们随后在未肌肉注射过PPV 疫苗的初产母猪，进行单次宫内免疫（Hamonic等，2020年）。使用灭活PPV加TriAdj单次宫内免疫未能触发强大的全身性或粘膜抗体介导的免疫。我们推测对免疫反应存在负面影响，因为兔子宫单次免疫后显然可以诱导强大的免疫应答。另外两个原因可能是猪需要多次免疫来建立强大的粘膜免疫和/或TriAdj未能突破粘膜屏障并启动猪粘膜表面的APC募集。

　　为探究多次免疫是否能够诱导粘膜免疫反应，我们在初产母猪发情配种时使用TriAdj配制的重组PEDV棘突蛋白（PEDVS）进行3次宫内免疫（Choudhary等，2021）。宫内免疫的精子经反复冻融后，死亡但不破裂。由于母猪无法怀孕，预料之中，它们大约3周后发情。重复模拟配种，直至第3个配种周期，使用活精进行宫内免疫。通过这种方法人为缩短免疫间隔期，当然宫内免疫实际可在每次怀孕时根据需要进行。初产母猪正常发情，它们的活仔数与对照母猪相当，证实输精联合宫内免疫不会影响精子功能、生殖力，也不会产生明显的抗精子免疫反应。经3次宫内免疫的猪，血清、子宫和初乳中的PEDVS抗体升高，且PEDV中和抗体滴度显著升高。初乳中含有较高的PEDVS中和抗体，可被动转移给哺乳仔猪。宫内免疫母猪的仔猪比对照母猪的仔猪约多存活1天，表明其对具有感染性的PEDV有部分抵抗力。我们怀疑初乳中的中和抗体量不足以保护仔猪免受疾病。

　　目前正在进行的研究为，以更强效的粘膜（无杀精作用）佐剂替代TriAdj，产生更强的免疫反应，以足以保护仔猪免受感染性PEDV或新生动物疾病的影响，或保护母猪免受繁殖性疾病（如PRRSV或PPV）的影响。研究包括，子宫如何作为免疫诱导位点。具体来说，我们探究疫苗是否能触发免疫细胞募集进入宫腔，这对诱导免疫至关重要，或者抗原是否穿过子宫壁，触发免疫。探究它如何穿过腔壁（细胞旁或细胞传递、树突状细胞延伸树突到肠腔内进行摄取等），以及抗原呈递给引流淋巴结还是淋巴聚集体。一旦明确了子宫作为免疫诱导位点的方式，我们就可利用这种作用机制来配制疫苗。

　　总之，我们倍感振奋，猪的宫内免疫似乎不影响精子功能、生殖力或仔猪生长动力学，并且它能够触发全身免疫和粘膜免疫。研究范围需要扩展更多可作为配方的佐剂，如配制成纳米颗粒，不会杀死精子。一旦完成，需要更大规模的试验来证明它可以产生强大的细胞和抗体介导的免疫，以保护母猪免受传染病和/或通过初乳中的中和抗体保护哺乳仔数。产业定能受益于一种可在母猪站定不乱动情况下给予的粘膜疫苗，且该免疫操作与现有的常规配种一举两得。